Введение в организационную обработку

«Обработка тканей» относится к ряду необходимых этапов, которые подготавливают ткань животного или человека от стадии фиксации до состояния достаточной инфильтрирования соответствующим гистологическим воском, что позволяет ее разрезать на микротом.

Важность обработки тканей

Руководители лабораторий часто подчеркивают важность обработки тканей для своих сотрудников. Крайне важно понимать, что использование неправильного графика обработки или внесение фундаментальных ошибок (таких как неправильное пополнение или секвенирование реагентов) может привести к тому, что образцы тканей не будут секциониемы. Это означает, что они не дадут никакой полезной визуальной информации. Эта ситуация особенно серьезна в диагностических тканях человека, потому что целые образцы обрабатываются в одной партии. Если ткань повреждена в таких случаях, может не быть запасной ткани для дальнейшего анализа, что приводит к ситуации, когда лаборатория должна объяснить пациенту, почему диагноз не может быть поставлен. Хотя механические или электрические неисправности автоматическая машина для обработки ткани может возникнуть, большинство проблем с обработкой вызваны человеческими ошибками. Поэтому, подчеркивая важность надлежащего образования и обучения для персонала обработки тканей имеет решающее значение. Необходимо проявлять осторожность при настройке программ обработки для любого запуска, чтобы обеспечить наилучшие результаты.

Обзор этапов обработки тканей секции парафина

1. Соберите свежие образцы

Свежие образцы тканей поступают из различных источников и склонны к повреждению при извлечении из пациентов или экспериментальных животных. Поэтому с ними нужно обращаться осторожно и фиксировать как можно скорее после рассечения. В идеале фиксация должна происходить на месте извлечения, например, в операционной. Если это невозможно, это должно быть исправлено немедленно по прибытии в лабораторию.

2. Фиксация

Образец погружают в жидкий фиксатор, такой как раствор формальдегида, такой как формалин. Этот агент постепенно проникает в ткань, вызывая химические и физические изменения, которые затвердеют и сохраняют ткань, защищая ее на последующих этапах обработки. Только несколько реагентов пригодны для фиксации, поскольку они должны обладать специфическими свойствами, подходящими для этой задачи. Например, компоненты ткани должны сохранять определенную химическую реактивность, чтобы впоследствии применять конкретные методы окрашивания. Формалин (обычно с фосфатным буфером) является наиболее часто используемым фиксативным веществом для сохранения тканей, которые будут перерабатываться в парафиновые секции. В идеале образцы должны оставаться в фиксирующим растворе достаточно долго, чтобы проникнуть во все части ткани, после чего следует период, позволяющий уравновесить химическую реакцию фиксации (время фиксации). Вообще, время фиксирования для образцов должно быть 6 до 24 часа. Большинство лабораторий рассматривают этап фиксации как первый этап программы обработки. После фиксации образцы могут потребовать дальнейшего рассечения для выбора соответствующих областей для оценки. Обработанные образцы помещены в как следует обозначенные кассеты (небольшие пефорированные корзины) для того чтобы дифференцировать их от других образцов. Продолжительность обработки образцов зависит от размера и типа самых больших и самых маленьких образцов, конкретного используемого процессора, выбранных растворителей, температуры растворителя и других переменных.

3. Обезвоживание

Поскольку расплавленный парафиновый воск является гидрофобным (плохо смешивается с водой), необходимо удалить большую часть воды из образцов перед проникновением воска. Этот процесс обычно включает погружение образцов в серию растворов этанола (спирта) с возрастающей концентрацией, кульминацией которых является абсолютный этанол. Этанол можно смешивать с водой в любом соотношении, постепенно заменяя воду в образцах спиртом. Использование постепенно увеличивающейся последовательности концентрации сводит к минимуму чрезмерную деформацию тканей.

Для образцов толщиной не более 4 мм типичная последовательность дегидратации составляет:

70% этанола 15 минут

90% этанола 15 минут

100% этанол 15 минут

100% этанол 15 минут

100% этанол 30 минут

100% этанол 45 минут

На этом этапе вся вода из образца, за исключением минимального количества плотно связанной (молекулярной) воды, должна быть удалена.

4. Расчистка

К сожалению, несмотря на то, что в ткани сейчас минимальное содержание воды, мы все еще не можем пропитать ее воском, потому что воск и этанол плохо смешиваются. Поэтому необходимо использовать промежуточный растворитель, совместимый как с этанолом, так и с парафином. Этот растворитель заменит этанол в ткани, который затем будет заменен расплавленным парафиновым воском. Эта фаза программы называется «очистка», а используемые химические вещества известны как «очистные агенты». Термин «клиринг» был выбран потому, что многие (но не все) клиринговые агенты, благодаря их относительно высокому показателю преломления, могут обеспечить некоторую степень оптической прозрачности или прозрачности ткани. Другой критическийФункция очищающих агентов извлечь большое количество сала из ткани, по мере того как сало препятствовало бы проникновению воска.

Ксилол является широко используемым клиринговым агентом, требующим многократных изменений для полной замены этанола.

Для образцов толщиной не более 4 мм типичная последовательность очистки включает: ксилол 20 минут, ксилол еще 20 минут, ксилол 45 минут.

5. Восковая инфильтрация

На этой стадии, ткань инфильтрируется с соответствующим гистологическим воском. Хотя многие различные реагенты были оценены и использованы на протяжении многих лет для выполнения этой задачи, гистологический воск на основе парафина остается наиболее широко используемым. Стандартный воск остается жидким при 60 ° C и может быть введен в ткань при этой температуре, затем охлажден до 20 ° C для затвердевания до текстуры, подходящей для последовательного разделения. Эти воски состоят из очищенного парафина и различных добавок, возможно, включая смолы, такие как стирол или полиэтилен. Важно понимать, что эти компоненты обладают специфическими физическими свойствами, позволяя разделять воск на тонкие ломтики размером до 2 микрон, образовывать ленты при разрезании на микротом и сохранять достаточную гибкость, чтобы оставаться плоским при плавании на теплой водяной бане.

Для образцов толщиной не более 4 мм типичная последовательность инфильтрации составляет:

Воск 30 минут

Воск 30 минут

Воск 45 минут

6. Встраивание или блокировка

После того, как образцы были тщательно пропитаны воском, их необходимо формовать в «блок», который будет установлен на микротом для разделения. Этот процесс включает в себя использование «центра встраивания», где расплавленный воск заливается в форму, и образец помещается в нее. Крайне важно уделять особое внимание правильной ориентации образца в плесени, так как положение образца будет диктовать «плоскость разделения», что жизненно важно в диагностической и исследовательской гистологии. Затем на верхнюю часть формы помещается кольцо для встраивания, добавляется больше воска, и вся сборка помещается на холодную пластину для затвердевания. Как только этот процесс будет завершен, тканевый блок вместе с прикрепленным к нему кольцом для встраивания может быть удален из формы и готов к микротомии. Стоит отметить, что если обработка ткани выполняется правильно, восковой блок, содержащий образец ткани, является очень прочным и может служить важным архивным материалом.